高效液相色譜系統主要有進樣系統、數據處理系統、輸液系統、檢測系統和分離系統。
1、進樣系統:一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作,進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2、數據處理系統:該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
3、
高效液相色譜系統中輸液系統:該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4x107pa,流速可調且穩定,當高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、ph值,或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質都能獲得有效分離。
4、檢測系統:高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
a、紫外檢測器 該檢測器適用于對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點:使用面廣;靈敏度高;線性范圍寬;對溫度和流速變化不敏感;可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
b、示差折光檢測器 凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。目前,糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7g/ml),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不適用于痕量分析,也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
c、熒光檢測器 凡具有熒光的物質,在一定條件下,其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物的測定,其靈敏度很高,痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可采用。
5、分離系統:該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm,內徑為2~5mm,由不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成,住內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成,它們都有惰性、多孔性和比表面積大的特點,加之其表面經過機械涂漬,或者用化學法偶聯各種基因或配體的有機化合物。因此,這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素(psa)后,就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外,固定相基質粒小,柱床極易達到均勻、致密狀態,極易降低渦流擴散效應?;|粒度小,微孔淺,樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析,基質粒度小,塔板理論數n就越大。這也進一步證明基質粒度小,會提高分辨率的道理。 再者,高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60c,通過改善傳質速度,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率。